الأدوية المضادة للنيكوتين: الأسس الدوائية والتطبيقات النفسية والعصبية

تلعب المنظومة الكولينية دوراً جوهرياً ومحورياً في ضبط التوازن النفسي والفسيولوجي داخل الجهاز العصبي البشري، حيث تنظم مساراتها طيفاً واسعاً من العمليات المعرفية، والانفعالية، والسلوكية. وتُعد الأدوية المضادة للنيكوتين (Antinicotinic Drugs) أو حاصرات المستقبلات النيكوتينية من أبرز الفئات الدوائية التي أسهمت في فك شفرات التفاعل المعقد بين النواقل العصبية والاضطرابات النفسية. تستعرض هذه المقالة الأكاديمية الشاملة الآليات الجزيئية لهذه المركبات، وتصنيفاتها الفارماكولوجية، وأبعادها العلاجية في الطب النفسي العصبي المعاصر.

مقدمة تأصيلية: ماهية الأدوية المضادة للنيكوتين وطبيعتها الوظيفية

تُعرّف الأدوية المضادة للنيكوتين بأنها مجموعة متباينة كيميائياً من المركبات القادرة على الارتباط بمستقبلات الأسيتيل كولين النيكوتينية (nAChRs)، ومنع تنشيطها الطبيعي بواسطة الأسيتيل كولين الداخلي أو الناهضات الخارجية كمركب النيكوتين. تتوزع هذه المستقبلات على نطاق واسع في الجهاز العصبي المركزي ومناطق الوصل العصبي العضلي والعقد الذاتية للجهاز العصبي المحيطي. وبالتالي، فإن التأثيرات الفسيولوجية المترتبة على استخدام هذه الحاصرات تتباين جذرياً تبعاً لنوع المستقبل المستهدف وموقعه التشريحي والقدرة الحركية للمركب الدوائي على النفاذ عبر الحاجز الدموي الدماغي.

تاريخياً، ارتبطت الأبحاث الأولية لمضادات النيكوتين بملاحظة تأثيرات السموم النباتية كالكورار (Curare)، الذي استُخدم في التجارب الفسيولوجية الرائدة لشل الحركة العضلية. ومع تطور العلوم الصيدلانية في منتصف القرن العشرين، انصب الاهتمام على حاصرات العقد الذاتية لمعالجة فرط ضغط الدم، قبل أن يدرك علماء الأعصاب والطب النفسي أن النواقل الكولينية النيكوتينية في الدماغ ليست مجرد محطات نقل حركية، بل تمثل شبكة دقيقة تدير إفراز الدوبامين، السيروتونين، الجلوتامات، وحمض الغاما-أمينوبوتيريك (GABA).

في السياق النفسي الحديث، تجاوزت مضادات النيكوتين دورها التقليدي كمجرد سموم أو أدوات بحثية مخبرية، لتصبح أسلحة بيولوجية واعدة لعلاج اضطرابات المزاج، والإدمان، ومتلازمات الحركة القهرية. ينبع هذا الاهتمام السريري المتزايد من قدرة بعض هذه المركبات النفاذة إلى الدماغ على إعادة تشكيل السيولة المشبكية وضبط الحلقات العصبية التي تعاني من فرط الاستثارة، مما يجعل فهم تفاصيلها الدوائية ضرورة ملحة لكل باحث وممارس في حقل العلوم العصبية والنفسية.

التصنيف الدوائي والآليات الجزيئية لحصار المستقبلات

تُصنف المستقبلات النيكوتينية كقنوات أيونية ذات بوابات ترتبط بالربيطة (Ligand-Gated Ion Channels)، وتتألف بنيوياً من خمس وحدات فرعية بروتينية تحيط بقناة مركزية تسمح بمرور الكاتيونات مثل الصوديوم والبوتاسيوم والكالسيوم. وتصنف الأدوية المضادة للنيكوتين استناداً إلى موقع عملها وآلية تفاعلها مع هذه الوحدات إلى فئات رئيسية تحدد خواصها العلاجية والسمية.

تشمل الفئة الأولى حاصرات الوصل العصبي العضلي (Neuromuscular Blockers)، مثل مركبات التوبوكورارين والبانكورونيوم، والتي تستهدف بصفة خاصة المستقبلات النيكوتينية من النمط العضلي (المكونة من الوحدات الفرعية α1, β1, γ, δ). تعمل هذه المركبات عن طريق التنافس المباشر مع الأسيتيل كولين على موقع الارتباط الأورثوستيري، مما يمنع إزالة الاستقطاب في الصفيحة الحركية الانتهائية ويسبب شللاً رخوياً في العضلات الهيكلية، وتقتصر استخداماتها الطبية بشكل رئيسي على التخدير العام والعناية المركزة، دون أن تمتلك تأثيراً نفسياً مركزياً مباشراً نظراً لعدم قدرتها على عبور الحاجز الدموي الدماغي.

أما الفئة الثانية فتتمثل في حاصرات العقد الذاتية (Ganglionic Blockers)، التي تستهدف المستقبلات النيكوتينية من النمط العصبي المحيطي والمركزي (المكونة أساساً من وحدات α3 وβ4). ومن أبرز أمثلة هذه المجموعة مركب الميكاميلامين (Mecamylamine) والهيكساميثونيوم. ويتميز الميكاميلامين بكونه أميناً ثانوياً غير متأين وذا قابلية عالية للذوبان في الدهون، مما يمنحه قدرة استثنائية على النفاذ بسهولة إلى أنسجة الدماغ وإحداث تأثيرات حركية وسلوكية ومعرفية معقدة عبر آليات الحصار غير التنافسي للقناة المفتوحة.

تعتمد الآلية الجزيئية لمعظم مضادات النيكوتين المركزية الحديثة على آليتين أساسيتين: إما التنافس الأورثوستيري الذي يزاحم النيكوتين والأسيتيل كولين على جيوب الارتباط بالوحدات ألفا، أو التثبيط التفارغي (Allosteric Modulation) وحصار مسام القناة الأيونية (Pore Blocking). يؤدي تثبيط مسام القناة إلى منع التدفق الكاتيوني حتى في حال ارتباط الناهض بالمستقبل، مما يقوض قدرة الغشاء بعد المشبكي على إزالة الاستقطاب، ويحول دون تفريغ الحويصلات الناقلة للمواد العصبية اللاحقة، مثلما هو موضح في النقاط التالية:

• الحصار التنافسي (Competitive Antagonism): يتميز بقابلية الإزاحة عند رفع تركيز النيكوتين أو الأسيتيل كولين، ويؤدي إلى إزاحة منحنى الجرعة والاستجابة نحو اليمين.
• الحصار غير التنافسي (Non-competitive Blockade): لا يتأثر بزيادة تركيز الربيطة الطبيعية، حيث يستقر الدواء داخل القناة الأيونية ذاتها ويغلقها ميكانيكياً.
• التعديل التفارغي السلبي (Negative Allosteric Modulation): ترتبط المركبات بمواقع مغايرة للموقع النشط، مسببة تغيراً في البنية الثلاثية للبروتين يقلل من ألفة المستقبل أو كفاءته في توصيل الأيونات.

التفاعل بين المنظومة الكولينية والدوبامينية والآثار العصبية السلوكية

يرتبط الجهاز الكوليني بروابط تشابكية وظيفية وثيقة مع مسارات الدوبامين في الدماغ، لا سيما في المسار الدوباميني الوسطي الحوفي (Mesolimbic Pathway) والمسار الدوباميني الوسطي القشري (Mesocortical Pathway). تتواجد المستقبلات النيكوتينية ذات البنية المتغايرة (α4β2) والمتجانسة (α7) بكثافة عالية فوق الأجسام الخلوية العصبية والنهايات المحورية العصبية في المنطقة السقيفية البطنية (VTA) والنواة المتكئة (Nucleus Accumbens).

عندما تُثبط هذه المستقبلات بواسطة الأدوية المضادة للنيكوتين، تنقطع الإشارات الكولينية التيسيرية التي تحفز خلايا الدوبامين، مما ينتج عنه انخفاض ملحوظ في معدل إطلاق الدوبامين المستحث بالنيكوتين أو بالمكافآت السلوكية المعززة. يُعد هذا التثبيط الكوليني-الدوباميني حجر الزاوية في تفسير قدرة مضادات النيكوتين على إخماد الاستجابات النفسية التواقة للمخدرات وقطع سلاسل المكافأة العصبية المسؤولة عن ترسيخ السلوكيات الإدمانية القهرية.

بالإضافة إلى ذلك، تتوسط المستقبلات النيكوتينية إفراز النواقل العصبية المثبطة عبر العصبونات البينية المفرزة لـ GABA، وكذلك النواقل الاستثارية كالجلوتامات في القشرة الجبهية والحصين. يؤدي تطبيق مضادات النيكوتين إلى إحداث خلل مقصود في التوازن بين الإثارة والتثبيط (E/I Balance)، مما قد يسفر، وفقاً للجرعة المستخدمة والنوع الدوائي، إما عن تهدئة الاستثارة القشرية المفرطة أو إحداث تبدلات مؤقتة في وظائف التشفير الحسي والانتباهي.

وقد أثبتت الدراسات الكهروفسيولوجية أن الحصار المزمن للمستقبلات النيكوتينية المركزية يؤدي إلى استجابة تعويضية شاذة تُعرف بـ “التنظيم التصاعدي للمستقبلات” (Upregulation)، حيث يزيد الدماغ من كثافة المستقبلات النيكوتينية غير الفعالة على أسطح الخلايا. يحمل هذا التكيف العصبي دلالات بالغة الأهمية لفهم متلازمات السحب والانتكاس السلوكي لدى الأفراد الذين يتعرضون للمركبات ذات الفاعلية المضادة للنيكوتين لفترات طويلة.

التطبيقات النفسية والسريرية لمضادات النيكوتين

شهدت العقود الأخيرة تحولاً نوعياً في تقييم الإمكانات العلاجية لمضادات النيكوتين في الطب النفسي، حيث تحولت النظرة إليها من مجرد مركبات مسببة للاضطراب الكوليني إلى أدوات فعالة لعلاج اضطرابات مستعصية تشمل الإدمان، والاكتئاب المقاوم للعلاج، والاضطرابات الحركية النمائية.

1. اضطراب تعاطي التبغ والإدمان الكيميائي

يمثل التبغ أحد أشرس أشكال الإدمان البيولوجي، حيث يستند في جوهره إلى قدرة النيكوتين على استثارة مستقبلات α4β2 في المنطقة السقيفية البطنية لإطلاق الدوبامين في النواة المتكئة، مما يولد مشاعر اللذة والتعزيز الإيجابي. يُستخدم مركب الميكاميلامين بصفته نموذجاً أصيلاً لمضادات النيكوتين في الدراسات السريرية لكسر حلقة هذا التعزيز؛ إذ يحجب المستقبلات ويمنع النيكوتين الخارجي من إحداث تأثيره الفسيولوجي الممتع، مما يؤدي إلى انطفاء تدريجي للاستجابة الشرطية المرتبطة بالتدخين.

وعلى الرغم من أن التأثيرات الجانبية المحيطية للميكاميلامين قد حدت من استخدامه كعلاج وحيد واسع النطاق، فقد قاد هذا المفهوم إلى تطوير استراتيجيات علاجية توليفية تعتمد على الجرعات المنخفضة، أو دمج مضادات النيكوتين مع لصقات النيكوتين الجلدية، مما يسهم في منع المتعة التدخينية بالتزامن مع تخفيف أعراض الانسحاب الجسدية القاسية.

2. الاضطراب الاكتئابي الجسيم ومفهوم التوازن الكوليني-الأدريناليني

تعود فكرة ارتباط المنظومة الكولينية بالاكتئاب إلى الفرضية الكلاسيكية التي وضعها العالم النفسي جانوفسكي (Janowsky) في سبعينيات القرن العشرين، والتي تفترض أن نوبات الاكتئاب تنشأ عن فرط الفاعلية الكولينية المركزية مقابل قصور في الفاعلية الأدرينالينية، في حين يمثل الهوس العكس تماماً. واستناداً إلى هذه الفرضية، أظهرت الأبحاث أن حجب المستقبلات النيكوتينية المركزية قد يمارس تأثيراً مضاداً للاكتئاب يحاكي أو يعزز تأثير الأدوية التقليدية.

وقد برهنت التجارب السريرية على مركب الميكاميلامين (واسمه التجاري في الأبحاث TC-5214) كعلاج معزز (Augmentation Therapy) لمضادات الاكتئاب التقليدية من فئة مثبطات استرداد السيروتونين الانتقائية (SSRIs). ومن المثير للاهتمام أن عقار البوبروبيون (Bupropion)، المعروف على نطاق واسع بوصفه مضاداً للاكتئاب ومساعداً في الإقلاع عن التدخين، يمتلك خصائص دوائية قوية كحاصِر غير تنافسي للمستقبلات النيكوتينية العصبية، ولا يقتصر عمله على تثبيط استرداد الدوبامين والنورإبينفرين، مما يثبت صحة المدخل الكوليني في معالجة الاضطرابات المزاجية المقاومة.

3. متلازمة توريت واضطرابات التشنج اللاإرادي (Tics)

تتميز متلازمة توريت بوجود تشنجات حركية وصوتية لا إرادية تنجم عن اضطراب في الدوائر العصبية القشرية-المخططية-المهادية-القشرية، مع فرط حساسية دوبامينية في الجسم المخطط. وُجد أن إعطاء مضادات النيكوتين المركزية، مثل الميكاميلامين، يُحدث تحسناً ملحوظاً في السيطرة على هذه التشنجات، خصوصاً عند دمجه مع مضادات الدوبامين النمطية أو غير النمطية كالهالوبيريدول أو الأريبيبرازول.

تستند هذه الاستجابة العلاجية إلى حقيقة أن حجب المستقبلات النيكوتينية يقلل من الاستثارة التيسيرية الكولينية للخلايا المفرزة للدوبامين في العقد القاعدية، مما يخفف من الاندفاعات العصبية الشاذة المسؤولة عن ظهور الحركات اللاإرادية والسلوكيات الوسواسية المرافقة للمتلازمة، ويمنح المرضى استقراراً سلوكياً دون الحاجة إلى جرعات مفرطة من مضادات الذهان التقليدية ذات الآثار الجانبية المرهقة.

التأثيرات المعرفية وعمليات التنظيم الانتباهي

تُعد العلاقة بين مضادات النيكوتين والأداء الإدراكي علاقة جدلية ومثيرة للاهتمام؛ فالأصل الفسيولوجي يشير إلى أن الأسيتيل كولين والنيكوتين يعززان الانتباه، وسرعة المعالجة الذهنية، والذاكرة العاملة من خلال تنشيط مستقبلات α7 وα4β2 القشرية والحصينية. وبناءً على ذلك، استُخدمت الأدوية المضادة للنيكوتين على نطاق واسع في النماذج التجريبية كأداة لإحداث عجز إدراكي اصطناعي (Cognitive Impairment Models) لمحاكاة الخلل المشاهد في داء ألزهايمر والفصام.

يؤدي إعطاء جرعات مرتفعة من حاصرات النيكوتين في حيوانات التجارب إلى تراجع واضح في اختبارات المتاهة المائية والذاكرة المكانية وقدرات التمييز الانتباهي. ومع ذلك، تكشف الدراسات النفسية الدقيقة أن التأثير ليس خطياً بالكامل؛ إذ إن الحصار الجزئي أو الانتقائي لبعض الأنواع الفرعية من المستقبلات النيكوتينية في بيئات عصبية تعاني من فرط النشاط الكوليني أو الخلل التوافقي قد يسهم في تحسين “ترشيح المثيرات الحسية” (Sensory Gating).

في الفصام، يعاني المرضى من اضطراب في ظاهرة تثبيط الموجة P50 (P50 Sensory Gating Deficit)، والتي ترتبط ارتباطاً وثيقاً بخلل وظيفي في مستقبلات α7 النيكوتينية المتواجدة في الحصين. يؤدي هذا الخلل إلى عجز الدماغ عن تصفية المعلومات الحسية المكررة وغير الضرورية، مما يغمر وعي المريض بالمنبهات الخارجية ويسهم في تشتت التفكير والهلوسات. ورغم أن التوجه السائد هو استخدام منشطات نيكوتينية انتقائية لتصحيح هذا القصور، فإن استخدام بعض المعدلات التفارغية ذات الخصائص التثبيطية المؤقتة قد سلط الضوء على أهمية الدقة الديناميكية في إدارة الحصار والتنشيط لهذه القنوات المعقدة.

التفاعل مع الضغوط النفسية ومحور الغدة النخامية والكظرية (HPA Axis)

تمارس الأدوية المضادة للنيكوتين تأثيراً مباشراً في ضبط استجابة الجسم والذهن للضغوط النفسية الشديدة والحادة، وذلك عبر تداخلها مع وظائف محور الوطاء-النخامية-الكظرية (HPA Axis). يحتوي الوطاء (Hypothalamus) على كثافة عالية من النهايات العصبية الكولينية التي تحفز، عبر المستقبلات النيكوتينية، إفراز الهرمون المطلق لموجهة القشرة (CRH).

عند تعرض الفرد للضغوط النفسية، يؤدي التنشيط الكوليني المستمر إلى تدفق هرمونات التوتر مثل الهرمون الموجه لقشر الكظر (ACTH) والكورتيزول. وتعمل حاصرات النيكوتين المركزية على قطع هذا التحفيز المفرط، مما يخمد نشاط المحور الكظري ويقلل من الأثر السمي العصبي الذي يسببه الارتفاع المزمن في مستويات الكورتيزول على خلايا الحصين واللوزة الدماغية (Amygdala).

وقد كشفت التجارب السلوكية على القوارض أن إعطاء الميكاميلامين بجرعات محسوبة يقلل من الاستجابات الشبيهة بالقلق في اختبارات المتاهة المصلبة المرتفعة (Elevated Plus Maze)، واختبارات الصدمة الشرطية، مما يبرز دور هذه العقاقير كعوامل محتملة لتخفيف الآثار النفسية الناتجة عن الصدمات واضطراب الكرب التالي للصدمة (PTSD)، حيث يتقاطع فرط النشاط الكوليني مع الاسترجاع القهري للذكريات المؤلمة.

الآثار الجانبية والمحددات الفارماكولوجية

لا تخلو الأدوية المضادة للنيكوتين من قيود دوائية وتأثيرات جانبية ناتجة عن انتشار مستقبلاتها في مختلف الأجهزة الفسيولوجية. ينبع الجانب الأكبر من هذه السمات غير المرغوبة من حصار العقد العصبية الذاتية في الجهازين الودي ونظير الودي، مما يؤدي إلى ظهور متلازمات سريرية تستوجب المراقبة الطبية الحثيثة.

تشمل الآثار الجانبية المحيطية الأكثر شيوعاً الناتجة عن حصار المستقبلات النيكوتينية الذاتية ما يلي:

• هبوط الضغط الانتصابي (Orthostatic Hypotension): ناجم عن شلل التنبيه الودي للمقاومة الوعائية وتثبيط المنعكسات الحركية الوعائية، مما قد يؤدي إلى الدوار والإغماء عند الوقوف المفاجئ.
• تثبيط الإفرازات اللعابية والمعوية: يؤدي إلى جفاف شديد في الفم، تباطؤ الحركة الدودية للأمعاء، والإمساك الشديد أو حتى العلوص الشللي (Paralytic Ileus).
• اضطرابات الرؤية: شلل المطابقة البصرية (Cycloplegia) وتوسع حدقة العين (Mydriasis) نتيجة إحصار التحكم الكوليني في العضلة الهدبية وعضلة الحدقة.
• الاحتباس البولي: نتيجة لضعف انقباض العضلة الدافعة للمثانة في الجهاز البولي.

على الصعيد المركزي، يمكن للأدوية المضادة للنيكوتين النفاذة إلى الدماغ أن تسبب في حال الجرعات المفرطة حالات من التخليط الذهني (Confusion)، التململ الحركي، التدهور المؤقت في وظائف الذاكرة القريبة، والتعب العام. وتتطلب هذه المحددات تصميم أجيال دوائية أحدث تمتاز بالانتقائية الصارمة للأنواع الفرعية المركزية لتجنب شلل الوظائف المستقلية المحيطية.

الآفاق المستقبلية والمستحضرات الدوائية الجيلية

يتجه البحث الصيدلاني والنفسي اليوم بعيداً عن الحاصرات النيكوتينية الشاملة غير الانتقائية، نحو تصميم جزيئات ذكية تُعرف بـ المعدلات التفارغية السلبية الانتقائية (Selective NAMs) والمناهضات الموجهة حصرياً نحو أنماط فرعية بعينها من المستقبلات، مثل المستقبلات النيكوتينية التي تحتوي على الوحدات α7 أو α4β2 أو α3β4.

تركز المشاريع البحثية الحديثة على تطوير مناهضات تستهدف الوحدة الفرعية α3β4 الكائنة في مسار العنانية-بين السويقتين (Habenulo-interpeduncular pathway). يلعب هذا المسار دوراً فائق الأهمية في إشارات النفور وتثبيط الرغبة الملحة لتعاطي المخدرات كالنيكوتين والمورفين والكحول؛ وتثبت المعطيات التجريبية أن الحصار الانتقائي لهذه المستقبلات قادر على كبح السلوك الإدماني دون التأثير على وظائف القلب والأوعية الدموية أو التسبب في هبوط الضغط.

علاوة على ذلك، يُجرى استكشاف إمكانية استخدام الأدوية المضادة للنيكوتين بالتزامن مع تقنيات النانو المتقدمة لإيصال الدواء إلى مناطق دماغية محددة بدقة، كالقشرة الجبهية الحجاجية أو اللوزة، بهدف معالجة الاضطرابات القهرية والوساوس المقاومة للعلاج الدوائي الاعتيادي، مع تقليل التعرض الجهازي إلى الحد الأدنى، وهو ما يفتح آفاقاً رحبة أمام طب نفسي جزيئي دقيق وشخصي.

خاتمة وتقييم تركيبي

تمثل الأدوية المضادة للنيكوتين ركيزة فريدة في فهم الفسيولوجيا العصبية للاضطرابات النفسية المعقدة، مبرهنة على أن تثبيط الإشارات الكولينية ليس دوماً فعلاً تخريبياً للوظائف الحيوية، بل قد يشكل في حالات محددة تدخلاً علاجياً حاسماً. ومن خلال قدرتها على تعديل مسارات الدوبامين، وتلطيف استجابة محور الكرب، وإعادة موازنة النشاط المشبكي في دوائر الاكتئاب والإدمان ومتلازمات الحركة، تثبت هذه المركبات أهميتها التاريخية والسريرية المستمرة. وسيبقى التحدي الأكبر للعلوم العصبية متمثلاً في ترويض هذه الفئة الدوائية عبر ابتكار مركبات فائقة الانتقائية تعزل المزايا النفسية والعلاجية الثمينة عن التبعات الجانبية غير المرغوبة للجهاز العصبي الذاتي.

المراجع

• Changeux, J. P. (2018). The nicotinic acetylcholine receptor: A typical allosteric machine. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 373(1749), 20170174. https://doi.org/10.1098/rstb.2017.0174
• Dani, J. A., & Bertrand, D. (2007). Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 47, 699-729. https://doi.org/10.1146/annurev.pharmtox.47.120505.105307
• Gotti, C., Clementi, F., Fornari, A., Gaimarri, A., Guiducci, S., Manfredi, I., Moretti, M., Pedrazzi, P., Pucci, L., & Zoli, M. (2009). Structural and functional diversity of native brain neuronal nicotinic receptors. Biochemical Pharmacology, 78(7), 703-711. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2009.05.024
• Janowsky, D. S., el-Yousef, M. K., Davis, J. M., & Sekerke, H. J. (1972). A cholinergic-adrenergic hypothesis of mania and depression. The Lancet, 300(7778), 632-635. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(72)93021-8
• Picciotto, M. R., Higley, M. J., & Mineur, Y. S. (2012). Acetylcholine as a neuromodulator: Cholinergic regulation of neurotransmitter release and its impact on behavior. Neuron, 76(1), 116-129. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2012.09.001
• Sanacora, G., & Chambers, J. (2014). Nicotinic receptor antagonists in the treatment of major depressive disorder: Focus on mecamylamine. Journal of Clinical Psychopharmacology, 34(3), 350-357. https://doi.org/10.1097/JCP.0000000000000109
• Shytle, R. D., Silver, A. A., Lukas, R. J., Newman, M. B., Sheehan, D. V., & Sanberg, P. R. (2002). Nicotinic acetylcholine receptors as targets for antidepressants. Molecular Psychiatry, 7(6), 525-535. https://doi.org/10.1038/sj.mp.4001040